アポトーシス細胞試験結果

全分子フコイダン及びフコキサンチン(アポルバノイド)
によるアポトーシス細胞試験

試料

【フコイダン末】

フコイダン(1g)を計りとり、蒸留水50mlを加え、遠心分離(3000rpm 4min)上澄を試料とする(T-1)
沈殿物0.4gを計りとり、グリセリン2.2gを加え、超音波により混和。蒸留水13mlを加え、遠心分離、上澄を試料をとする(T-2)

【アポトータル®】

PH3.8→IN NaOHでPH調整。7.02に中和。遠心分離(3000rpm 4min)上澄を試料とする(T-3)
沈殿物0.4gを計りとり、グリセリン2.2gを加える。蒸留水15.6gを加え、遠心分離(3000rpm 4min)上澄を試料とする(T-4)

【細胞操作】

培養中のフラスコより古い培地を取り除き、酵素反応(トリプシン)5mlを加える。3~4分時間を置き、培地を加え遠心分離を行う。
10mlをとり、遠心分離を行い培地+酵素を取り除く。
PBSを1ml加えピペッティング、マイクロペピットで10μを取り細胞数をカウントする

フコイダン 試料

フコキサンチン(アポルバノイド)によるアポトーシス・細胞障害性の策定

方法

アポトーシス細胞を固定、浸透させ細胞をTUNEL反応溶液でインキュベートし、インキュベーションの間、TdTは一本鎖および二本鎖DNAのフリーの3`‐OH末端にフルオレセイン‐dUTPを標識する反応を触媒する。
洗浄後、DNAの切断部分に取り込まれた標識物を酵素標識抗フルオレセイン抗体と反応させ、未反応の標識抗体を洗浄除去した後、免疫複合体のおける酵素を基質と反応させ、可視化させる。

試料

サイトスピンおよび細胞スメアや、スライドグラス上で成長した粘着細胞、凍結またはパラフイン包埋切片。

フコキサンチン 試料

結果

がん細胞の核が青く染色され、フコキサンチン(アポルバノイド)がガン細胞の内部、核に影響を与えアポトーシスしたことが考えられる。

考察

本実験では、対照の核が青く染色されず、フコキサンチン群(原液の400倍稀釈試験液)では、上図のように、明瞭にその反応を認めた。

本実験条件はフコキサンチン、8時間処理実験の結果である。今後の実験は、その再現性を確認すること。
フコキサンチン原液は1%フコキサンチンしか含まれていないことから、それの原液を薄層クロマトグラフィー法でさらに分離精製して、より高濃度のフコキサンチンをがん細胞に投与し、アポトーシス反応を確実にすること。この2点を来年当初の実験としたい。

現段階では、以下の表現がふさわしい。培養がん細胞に対し、フコキサンチン(アポルバノイド)がアポトーシスを誘起するか、TUNEL法を用いて検討した。その反応を認めたが、再現性の確認などさらなる実験も必要である。

本実験 フコキサンチンがアポトーシスを誘起するか

試験結果

Blank

きれいな細胞の状態で増殖している

フコキサンチン

細胞のかたちは見られず、丸い核が残った状態となる

試料T−1

細胞数が極端に減少しているが、細胞の形はしっかりと形を残す

試料T−2

細胞の数は減少している。一部細胞が固まりかけている

試料T−3

細胞の形はとどめているが増殖率が悪い。
固まりがあり、阻害を受けていると思われる。

試料T−4

細胞の形は留めているが、増殖率が悪い

総評

総体的に、がん細胞がそれぞれの試料で影響を受けていることが分かる。
フコキサンチン(アポルバノイド)については、細胞本来の形が見られず、丸い核のみが残った状態となる。
また、T−2、T−3、T−4については細胞の塊。

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